上海核酸快速检测6篇上海核酸快速检测 1.ChinaMedicalDeviceInformation|中国医疗器械信息论著 Article2019年12月爆发的新型冠状病毒下面是小编为大家整理的上海核酸快速检测6篇,供大家参考。
篇一：上海核酸快速检测
. China Medical Device Information | 中国医疗器械信息论著Article2019年12月爆发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）为新发急性呼吸道传染病，它是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染导致，其传染性强，对人类健康和经济生活造成重大影响。新冠核酸检测是新型冠状病毒肺炎诊断、治疗效果、发生疫情时人群筛查及流行病学调查的重要手段 [1] 。利用实时荧光RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸，由于其灵敏度高，特异性强，是现阶段检测新冠病原体的主要手段。但其检测过程繁琐，时间过长，技术要求高，难以实现对标本的快速现场检测。为缩短检测时间，减少实验过程中对辅助仪器设备、PCR实验室建设的要求，因此许多基于核酸等温扩增技术的SARS-CoV-2快速核酸检测分析仪相继诞生，可实现新冠核酸的现场快速筛查 [2] 。依据中国合格评定国家认可委员会（CNAS）颁布的CNAS-CL02:2012《医学实验室质量和能力认可准则》及分子诊断领域的应用说明（CNAS-CL02-A009:2018）要求，开展检验项目前需对检测系统进行性能验证，是否满足临床诊疗要求，PCR定性检测项目验证至少应包括方法符合率、检出限、抗干扰能力、交叉反应等 [3,4] 。本研究参照CNAS-GL039 《分子诊断检验程序性能验一种国产新型冠状病毒核酸快速检测分析仪的性能验证刘文明
江涛
吴友琴
汤思曼
中信惠州医院检验科
（广东 惠州
516006）收稿日期：
2021-08-03文章编号：1006-6586(2021)22-0001-03
中图分类号：R197.39
文献标识码：A内容提要：
目的：评估国产新型冠状病毒核酸快速检测分析仪优思达UC0108的性能，是否满足临床对SARS-CoV-2快速核酸检测要求。方法：依据CNAS-GL039:2019等相关标准和文件，使用国家和广东省临检中心新冠核酸室间质评样品、第三方厂家质控品等，对杭州优思达UC0108新冠核酸快速检测分析仪（含配套试剂盒、耗材）的方法符合率、检出限、交叉反应、抗干扰能力和重复性进行性能验证，验证结果在厂家声明的性能指标范围内或是满足本实验室的执行标准为验证通过。结果：通过检测国家和广东省临检中心室间质评样品5例阴性和15例阳性，方法符合率均100%。通过对邦德盛新冠核酸标准物质稀释至厂家声明的检测限浓度200copies/mL，重复测定5次，100%检出靶核酸。抗干扰能力挑选人类血液（1%）和利巴韦林进行验证，重复测定3次，弱阳性样本仍为弱阳性结果。交叉反应挑选流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌进行验证，重复检测3次，均为阴性。重复性验证通过2人、20d、2批次试剂盒对昆涞生物阴性和弱阳性质控品进行检测，符合率100%。结论：杭州优思达UC0108新冠核酸快速检测分析仪检测SARS-CoV-2方法符合率、检出限、交叉反应、抗干扰能力、重复性等性能指标达到厂家声明的性能指标，可满足新冠核酸快速检测要求。关 键 词：
新型冠状病毒
快速核酸检测
性能验证Performance Verif i cation of A Domestic SARS-CoV-2 Nucleic Acid Rapid Detection AnalyzerLIU Wen-ming
JIANG Tao
WU You-qin
TANG Si-man
Inspection Department, Citic Huizhou Hospital
(Guangdong Huizhou
516006)Abstract: Objective: To evaluate the performance of the domestic new coronavirus nucleic acid rapid detection analyzer Ustar UC0108, and whether it meets the clinical requirements for SARS-CoV-2 rapid nucleic acid detection. Methods: According to CNAS-GL039:2019 and other relevant standards and documents, using the national and Guangdong Provincial Pre-Inspection Center new coronal nucleic acid room inter-quality assessment samples, third-party manufacturers quality control products, etc., the method of Hangzhou Ustar UC0108 new coronary nucleic acid rapid detection analyzer (including kits, consumables) method compliance rate, detection limit, cross-reaction, performance verif i cation of anti-jamming capability and repeatability, the verif i cation results within the scope of the manufacturer’s stated performance indicators or to meet the laboratory’s performance standards for verif i cation pass. Results: Through the testing of the national and Guangdong Provincial Clinical Examination Center, 5 cases were negative and 15 cases were positive, and the method compliance rate was 100%. By diluting the Bangdex Covid-19 nucleic acid standard material to the detection limit concentration declared by the manufacturer of 200 copies/mL, repeat the measurement 5 times, and 100% of the target nucleic acid was detected. The anti-interference ability was verif i ed by selecting human blood (1%) and ribavirin. The measurement was repeated 3 times, and the weakly positive samples were still weakly positive. The cross-reaction was verif i ed by selecting Haemophilus inf l uenzae and Klebsiella pneumoniae, and the test was repeated 3 times, all of which were negative. The reproducibility verif i cation was carried out by 2 persons, 20 days, and 2 batches of kits to detect Kunlai Bio-negative and weakly positive quality control products, with a compliance rate of 100%. Conclusion: Hangzhou Ustar UC0108 new crown nucleic acid rapid detection analyzer detects SARS-CoV-2 performance indicators such as compliance rate, detection limit, fork reaction, anti-jamming ability and repeatability meet the performance targets declared by the manufacturer, which can meet the requirements of the new coronary nucleic acid rapid detection.Key words: SARS-CoV-2,
rapid nucleic acid testing,
performance verif i cation
. 2中国医疗器械信息 | China Medical Device Information论著Article证指南》 [5] ，对杭州优思达公司生产的UC0108新冠核酸快速检测分析仪进行性能验证，结果如下。1. 资料与方法1.1一般资料符合率验证采用2021年全国新冠核酸室间质评样本和2021年广东省新冠核酸室间质评样本；检出限验证采用广州邦德盛生物科技有限公司新冠核酸标准物质（编号：GBW(E)091132）；重复性验证采用上海昆涞生物科技有限公司弱阳性2019-nCoV核酸非定值质控品828-B（批号：4EFC3DB）和阴性2019-nCoV核酸非定值质控品827-N（批号：4EDEEB7）。1.2仪器与试剂杭州优思达生物技术有限公司生产的核酸扩增检测分析仪，型号：UC0108；配套优思达新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（恒温扩增-实时荧光法）。1.3方法1.3.1检测系统采用交叉引物恒温扩增技术（CPA）检测新型冠状病毒的ORFlab基因和N基因。接受过上岗培训和考核的持证工作人员按照仪器和试剂说明书编写的SOP规范操作，检测样本，检测程序运行结束后，仪器自动报告阴/阳性。1.3.2符合率验证：通过检测2021年（第一次和第二次）全国临检中心新冠核酸室间质评样本；2021年（第一次和第二次）广东省临检中心新冠核酸室间质评样本，进行符合率计算，符合率100%为验证通过。1.3.3检出限验证：优思达试剂盒说明书声明的最低检测限为200 copies/mL。将浓度为2.0×10 5
copies/mL的广州邦德盛新冠核酸标准物质（编号：GBW(E)091132）用采样液稀释为200 copies/mL，重复测定5次，100%检出靶基因为验证通过。1.3.4重复性验证：利用上海昆涞生物新冠核酸弱阳性质控品828-B（批号：4EFC3DB）和阴性质控品827-N（批号：4EDEEB7）进行20d、2人、2批次试剂每日质控检测，弱阳性质控品检测结果均为阳性、阴性质控品均为阴性为验证通过。1.3.5干扰物质验证：根据试剂说明书，通过对加入了内源性干扰物质人类血液（1% V/V）和外源性干扰物质利巴韦林（150μg/mL）上海昆涞生物新冠核酸弱阳性质控品828-B（批号：4EFC3DB），重复测定3次。100%为阳性为通过验证。1.3.6交叉反应验证：根据试剂说明书，选择加入本科室微生物室经鉴定后的流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌灭活培养物的样本采集管中进行检测，重复测定3次，结果均为阴性为验证通过。2. 结果2.1符合率全国临检中心2021年（第1次和第2次）新冠核酸室间质评样本检测结果：样本编号202111、202112、202113、202114、202121、20222、202123、202125 均 为 阳 性； 样本编号202115、202124均为阴性。广东省临检中心2021年（第1次和第2次）新冠核酸室间质评样本检测结果：样本编号20200301、20200302、20200303、20200305、20210201、20210203、20210205结果均为阳性；样本编号20200304、20210202、20210204结果均为阴性。5例阴性标本全部检测为阴性，阴性符合率100%；15例阳性样本全部检测为阳性，阳性符合率100%；总符合率为100%，验证通过，结果见表1。广东省临检中心室间质评样本靶基因检测结果：样本编号20200301、20200302、20200303、20200305、20210201、20210203、20210305 ORFlab基因和N基因均为阳性；20200304、20210202、20210204 ORFlab基因和N基因均为阴性，与预期结果一致，符合率100%。结果见表2。表1. 符合率验证结果表预期结果总数阳性 阴性UC0108结果阳性 15 0 15阴性 0 5 5总数 15 5 20注：阳性符合率=15/15×100%=100%；阴性符合率=5/5×100%=100%；总符合率=20/20×100%=100%。表2. 靶基因符合率结果表预期结果总数阳性 阴性ORFlab基因阳性 7 0 7阴性 0 3 3N基因阳性 7 0 7阴性 0 3 3注：ORFlab基因、N基因 阳性符合率=7/7×100%=100%；ORFlab基因、N基因 阴性符合率=3/3×100%=100%；ORFlab基因、N基因 总符合率=10/10×100%=100%。表3. 检测限验证结果表结果检出率重复测试数 阳性数目标基因ORFlab基因 5 5 100%N基因 5 5 100%
3 . China Medical Device Information | 中国医疗器械信息论著
Article2.2检出限对试剂说明书声明的最低检测限200 copies/mL样本经5次重复检测，100%检测出靶基因。结果见表3。2.3抗干扰能力重复测定3次加入了内源性干扰物质人类血液和外源性干扰物质利巴韦林的昆涞弱阳性质控品，100%阳性，验证通过。2.4交叉反应重复测定3次加入了流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯氏菌灭活培养物的样本采集管，结果均为阴性，验证通过。2.5重复性通过进行20d、2人、2批次试剂对昆涞阴性和弱阳性质控品的检测，结果阴性质控均为阴性，弱阳性质控结果均为阳性，符合率100%。人员比对、日内日间重复性、试剂批内批间重复性验证通过。3. 讨论在我国高效的抗疫防控措施下，国内疫情得到有效控制，但由于境外新冠肺炎疫情仍在暴发流行，我国存在疫情输入和扩散风险。根据最新国家新冠肺炎诊疗方案第8版，确诊新冠肺炎金标准仍为新冠病毒核酸检测。通过筛查感染者并及时进行隔离是防控疫情的关键手段，在疫情爆发初期，快速进行确诊和排除是疫情防控的首要任务。逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）由于其高灵敏度和高特异性，是目前SARS-CoV-2核酸检测的首选方法。但其检测过程中步骤过多，经核酸提取、变性、退火、延伸等使整个扩增检验时间较长，且对操作人员、设备及实验室环境等有较高要求 [6] ，不适合现场快速核酸检测。核酸恒温扩增技术无需热循环仪，扩增效率高、检测速度快，适合于新冠核酸的快速检测。目前主要的恒温扩增技术有依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）、重组酶聚合酶扩增技术（RPA）、环介导等温扩增技术（LAMP）、智能扩增反应（SMAP）、交叉引发扩增技术（CPA）等 [7] 。为达到新冠核酸检测的快捷简便，基于恒温扩增方法的仪器进入临床应用，有向即时检测（POCT）方向发展的趋势，但暂时达不到POCT的要求，行业里对这类型仪器使用“快速检测”来表述。杭州优思达UC0108即采用交叉引物恒温扩增技术（CPA）检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）特异性的ORFlab基因和N基因，实现“一管式“的全自动核酸分析即在一个密闭的检测管内完成裂解结合、清洗、洗脱和扩增反应，最快完成一个标本检测79min。在正式用于患者标本检测前，对仪器分析系统进行性能验证，确认检测系统符合临床应用要求方可用于常规检测。基于核酸恒温扩增技术的核酸快速检测系统近期在我国大量出现用于临床，在一定程度上缩短了检测时间，减少了所需的辅助设备，降低了对实验室的要求，但其应用时间不长，各个仪器厂家和各种技术原理并不一致，所以对其进行系统详细的性能验证和评价至关重要。相关国家标准也要求在正式用于患者标本检测前，对仪器分析系统进行性能验证，确认检测系统符合临床应用要求方可用于常规检测。现阶段基于恒温扩增技术的新冠核酸快速检测仪相对于常规的RT-PCR新冠核酸检测，样本检验全程所用时间明显缩短，仪器一般具有小型化、一体化的特点。可做为常规新冠核酸检测的补充，在特定情形下需尽快获得检验结果、标本较少、实验室条件有限等，可考虑采用新冠快速检测，为经济不发达地区和基层医疗机构提供了有力的防疫保障。由于其通量一般较小，也不适合大量人群筛查。由于新冠肺炎疫情突发，基于恒温扩增技术的分析系统研发时间和审批时间较短，临床应用时间不长，其技术成熟度、仪器稳定性、检测性能还需进一步观察，也不建议用于疑似患者的确诊、确诊患者的疗效观...
篇二：上海核酸快速检测
转自：央广网 央广网上海 6 月 11 日消息（记者杨静 林馥榆）6 月 11 日，上海举行新冠肺炎疫情防控工作第 209 场新闻发布会。发布会上，上海市疫情防控核酸筛查专班负责人夏科家表示，为进一步巩固上海疫情防控成果，确保广大市民生命安全和身体健康，根据《中华人民共和国传染病防治法》《突发公共卫生事件应急条例》等法律法规，按照国家和上海市疫情防控有关规定，现就对上海未按规定参加核酸检测人员“随申码”赋黄码等有关事项通告如下：一、上海市常态化核酸检测点免费检测服务，延长至 2022 年 7 月 31 日。
二、即日起至 2022 年 7 月 31 日，市民应每周至少进行 1 次核酸检测。市民如7 天内无核酸检测记录，其“随申码”将会被赋黄码；完成核酸采样后，其“随申码”将在 24 小时内转码。
三、7 天内无核酸检测记录的市民，应及时参与社区便民筛查或至核酸采样点开展核酸检测。对“应检未检”并造成疫情传播扩散的，将依法追究相应法律责任。
四、除进出所居住小区、前往核酸采样点进行核酸检测、就医等外，被赋黄码人员非必要不外出，尽量减少与他人接触，避免前往人群聚集公共场所。
五、对长期卧床重病患者、行动不便老人、残障人士、婴幼儿等特殊人群，各区要提供核酸检测便利服务。
六、市民如对其“随申码”赋码有异议的，可通过“随申办”或“12345”市民服务热线等渠道反映。
七、本通告自发布之日起施行，有效期至 2022 年 7 月 31 日。后续将根据疫情防控形势变化动态调整。
篇三：上海核酸快速检测
iddot; 论著 ·一种淋球菌核酸快速检测方法的建立与评价 王志宇１ 屠博文２ 陈红岩１（１ ． 复旦大学生命科学学院 ，上海 ２０００８２ ；２ ． 常州市疾病预防控制中心 ，江苏 常州 ２１３０２２）
［摘要］【目的】建立一种淋球菌核酸的快速检测方法 ，并对该方法的灵敏度 、特异性以及与荧光定量 PCR 方法的检测结果一致性进行初步评价 。
【方法】使用重组酶聚合酶扩增‐侧流层析分析（RPA‐LFA）技术建立淋球菌核酸快速检测方法 。
使用淋球菌核酸检测国家参考品对该方法的分析灵敏度与分析特异性进行评价 ；使用已上市的淋球菌核酸检测荧光定量 PCR 法试剂盒 、RPA‐LFA 法分别对临床采集的 ６１ 份生殖道分泌物样本进行检测 ，对检测结果进行一致性评价 。
【结果】RPA‐LFA 法的分析灵敏度为 １０ ４ cells／mL ；分析特异性良好 ，对 １０ 株不同淋球菌菌株均可测出 ，对 １０ 株非淋球菌菌株均不能测出 ；RPA‐LFA 法与荧光定量 PCR 方法检测一致性高（Kap‐pa＝ ０ ． ９７）
，RPA‐LFA 法的阳性检出率为 ５２ ． ５％ （３２／６１）与荧光定量 PCR 法的阳性检出率 ５４ ． １％ （３３／６１）相比较差异无显著性（ P ＞ ０.０５）
；以荧光定量 PCR 方法为参比 ，RPA‐LFA 方法检测灵敏度为 ９６ ． ９７％ ，检测特异性为１００ ． ００％ ；单个样本实时荧光定量 PCR 方法流程时间为 １２０ ± ２０min ，明显长于 RPA‐LFA 的（３５ ± ５）min ，且两者比较差异有显著性（ P ＜ ０.０５）。
【结论】成功建立了 RPA‐LFA 淋球菌核酸快速检测方法 ，该方法与荧光定量PCR 法检测结果一致性高 ，且不需要复杂精密的温控设备 ，检测结果判读简单 ，缩短了淋球菌核酸检测的时间 ，降低了成本 。
［关键词］ 奈瑟氏球菌 ，淋病 ； 核酸类Establishment and Evaluation of a Rapid Detection Method for Neisseria Gonorrhoeae Nucleic Acid
WA NG Zhi ‐ yu ， TU Bo ‐ wen ， CHEN Hong ‐ yan （ School of Life Sciences Fudan University ，Shanghai ，２０００８２）
［Abstract］【Objective】To establish a Neisseria gonorrhoeae （NG）
nucleic acid rapid test method and assess the ana‐lytic sensitivity and specificity and detection consistency with quantitative PCR method ．【Methods】
The rapid detectionmethod of Neisseria gonorrhoeae nucleic acid was established by RPA‐LFA ；the sensitivity and specificity of the methodwere evaluated by using the national reference for Neisseria gonorrhoeae nucleic acid detection ；sixty‐one samples of clini‐cal genital secretions were detected by fluorescence quantitative PCR kit and RPA‐LFA respectively ，and the consistencyof the detection results was evaluated ． 【Results】The sensitivity of RPA‐LFA method was １０ ４ cells／mL ，the specificity wasgood ，１０ different Neisseria gonorrhoeae strains could be detected ，１０ non Neisseria gonorrhoeae strains could not be de‐tected ．The consistency between RPA‐LFA method and fluorescent quantitative PCR method was high （ Kappa ＝０.９７）
，the positive detection rate of RPA‐LFA method was ５２ ． ５％ （３２／６１）
and that of fluorescent quantitative PCRmethod was ５４ ． １％ （３３／６１）
．The sensitivity and specificity of rpa‐lfa were ９６ ． ９７％ and １００ ． ００％ respectively ，and theflow time of real‐time PCR for single sample was １２０ ± ２０min ，significantly longer than ３５ ± ５min of RPA‐LFA （ P ＜０.０５）
． 【Conclusion】The RPA‐LFA method for rapid detection of Neisseria gonorrhoeae nucleic acid is successfully estab‐lished ．The method has high consistency with the fluorescent quantitative PCR method ，and does not need complex andprecise temperature control equipment ．The interpretation of detection results is simple ，which shortens the detection timeof Neisseria gonorrhoeae nucleic acid and reduces the cost ．
［Key words］ Neisseria ，Gonorrhoeae ； Nucleic Acids［中图分类号］ R３７８ ． １６ ［文献标识码］ A ［doi ：１０ ． ３９６９／j ． issn ． １６７１‐７１７１ ． ２０２０ ． ０７ ． ００７］［文章编号］ １６７１‐７１７１（２０２０）０７‐０９８２‐０４
淋病的病原菌为淋病奈瑟菌（Neisseria Gonor‐ rhoeae ，NG）
，具有很强的侵袭力和适应性［１］。
由于· ２ ８ ９ · 医学临床研究 ２０２０ 年 ７ 月 第 ３７ 卷 第 ７ 期 J Clin Res ，Jul ．２０２０ ，Vol ３７ ， № ７ ［基金项目］ 江苏省卫生健康委科研课题面上项目（H２０１８０９８）
通讯作者 ：E‐mail ：chenhy＠ fudan ． edu ． cn
感染初期人体常没有症状或症状不典型［２］，因此及时准确诊断淋球菌感染已成为治疗淋病的关键 。
目前国内临床使用的淋球菌检测方法主要有分离培养法和分子生物学检查法 。
分离培养法其用时长 ，而且可能会造成漏检［３］。
荧光定量 PCR 是临床常使用的淋球菌分子生物学检查方法 ，其检测淋球菌的阳性率要显著高于培养法［４］。
但是其需要专门设备及人员 ，难以在基层医院 、欠发达地区应用 。重组酶聚合酶扩增（RPA）技术是一种新型等温扩增技术 ，扩增时间短 ，产物可通过侧流层析分析（LFA）进行结果判断 ，在病原体核酸的快速检测上具有较大的应用潜力［５］。本研究建立了淋球菌核酸的 RPA‐LFA 检测方法 ，并对该方法进行了灵敏度 、特异性以及与荧光定量 PCR 方法检测结果一致性的评价 。１ 材料与方法１ ． １ 材料 菌株来源 ：淋球菌核酸检测国家参考品购自中检院 ，包含 １０ 株淋球菌以及 １０ 株非淋球菌 ：铜绿假单细胞菌株（CMCC １０１０４）
，金黄色葡萄球菌株 （CMCC ２６００１ ）
，脑膜炎耐瑟菌株 （CMCC２９０１８ 、２９２０４）
，干酪乳杆菌株（CMCC ３４１０３）
，大肠埃希菌株 （CMCC ４４０１３ ）
，变性杆菌株 （CMCC４９１０２）
，伤寒沙门菌株（CMCC ５００９６）、福氏志贺菌株（CMCC ５１５７３）
，白色念珠菌株（CMCC ９８００１）。样本来源 ：６１ 份样本来源于上海皮肤病医院疑似性病的门诊病人 ，其中男性 ４８ 份 ，女性 １３ 份 。
男性患者用消毒棉拭伸入尿道约 ２ ～ ４ cm ，捻取尿道分泌物 ；女性用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物 ，再用灭菌棉拭于宫颈内采取分泌物 ，采集的分泌物放入采样管中 。
仪器与试剂 ：ABI ７５００ 荧光定量PCR 仪（ABI 公司）
；T１００ PCR 仪（Biorad 公司）
；高速离心机（Eppendorf 公司）
；TwistAmp®nfo 试剂盒（Twist Dx 公司）
，HybriDetect １ 试纸条（Milenia公司）
；淋球菌核酸检测试剂盒（荧光定量 PCR 法）购自江苏硕世生物科技股份有限公司 ；引物 、探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成 。１ ． ２ 方法１ ． ２ ． １ RPA‐LFA 引物探针设计 根据淋球菌 porA 假基因 ，设计引物与探针 ，引物探针序列见表 １ 。１ ． ２ ． ２ 淋球菌标准菌株核酸检测 将国家参考品P１ ～ P１０ 样本取出 ，融化后各取 １００ μ L ，１２０００ r／min 离心 ２ min ，去除上清后加入裂解液 １００ μ L ，常温裂解 １０ min 。
之后取 １ μ L ，按照表 ２ 进行反应液混合液配制 。将反应混合液加入到 TwistAmp®nfo试剂盒提供的八联管中 ，再加入 １ μ L 样本与 ２ ． ５ μ LMgOAc（２８０ mM）。将八联管置于 PCR 上 ，设置反应温度为 ３７ ℃ 。反应 ５ min 时将八联管取出 ，振荡混匀后继续反应至 ２０ min 。
扩增完成后 ，取反应产物 １０μ L 至一个 １ ．５ mL 离心管中 ，加入 ９０ μ LPBST ，混匀后 ，插入试纸条 ，计时 ５ min 后取出试纸条判读结果 。表 １ RPA‐LFA 法引物探针序列 引物／探针 序列Forward ５＇ ‐GTTTCAGCGGCAGCATTCAATTTGTTCCGAGT‐３＇Reverse５＇ ‐Biotin‐GTAATTCAGACCGGCATAATACACATCCGACCC‐３＇Probe５＇ ‐FAM‐CAAAACAGCAAGTCCGCCTATACGCCTGCTAC［T HF］TTCACGCTGGAAAGT‐C３‐３＇
C３ 为 C３ Spacer表 ２ RPA‐LFA 法反应体系组分 浓度 体积Forward Primer １０ μ M ２
． ４ μ LReverse Primer １０ μ M ２
． ４ μ LProbe １０ μ M ０
． ８ μ LRehydration Buffer ／ ２９
． ５ μ LH ２ O ／ １１
． ４ μ L１ ． ２ ． ３ RPA‐LFA 法分析灵敏度检测 将国家参考品中最低检出限参考品 NG‐S（１０５cell／mL）稀释 １０倍（１０４cell／mL）
，取 ４ 个 NG‐S 以及 １０ 个稀释 １０倍后的 NG‐S ，按照 １ ． ２ ． ２ 中的步骤进行核酸提取 、扩增以及检测 。１ ． ２ ． ４ RPA‐LFA 法分析特异性检测 将国家参考品中 N１ ～ N１０ ，按照 １ ． ２ ． ２ 中的步骤进行核酸提取 、扩增以及检测 。１ ． ２ ． ５ 临床样本预处理 在采样管中加入 １ ． ５ mL无菌生理盐水 ，在旋涡振荡器上振荡 １０ min 后 ，吸取 ５００ μ L 样本放入 １ ． ５ mL 离心管中 。
每个采样管中的液体吸取 ２ 次 ，分别用于 RPA‐LFA 法及荧光定量 PCR 法的检测 。１ ． ２ ． ６ RPF‐LFA 法与荧光定量 PCR 法一致性评价 荧光定量 PCR 法 ：采用试剂盒自带的核酸提取试剂 ，按照说明书进行核酸提取 。
提取后取 ５ μ L 作为模板 ；按照试剂盒说明书 ，取 １８ μ L 反应液和 ２ μ L酶混合液配制成反应混合液 ，加入样本 、阳性对照 、阴性对照各 ５ μ L 。
总反应体系为 ２５ μ L 。PCR 的循环条件为 ：３７ ℃ ５ min ，９５ ℃ ５ min ；然后 ９５ ℃ １０ s ，５５ ℃ ４０ s ，４０ 个循环 ；结果阴阳性判断按照试剂盒说明书进行 。
RPA‐LFA 法 ：将预处理的样本按照１ ． ２ ． ２ 的步骤 ，进行核酸提取 、扩增以及检测 。· ３ ８ ９ · 医学临床研究 ２０２０ 年 ７ 月 第 ３７ 卷 第 ７ 期 J Clin Res ，Jul ．２０２０ ，Vol ３７ ， № ７
１ ． ３ 统计学处理 以荧光定量 PCR 法为参比方法 ，RPA‐LFA 为考核方法采用配对四格表进行Kappa 值 、检测灵敏度 、检测特异性的计算 。２ 结果２ ． １ 淋球菌核酸检测分析特异性 如图 １ 所示 ，所有 １０ 株淋球菌标准菌株全部检出 ，所有 １０ 株非淋球菌菌株全部未检出 。图 １ 淋球菌国家参考品检测结果图２ ． ２ 淋球菌核酸检测分析灵敏度 如图 ２ 所示 ，１０４cell／mL 可被检出 。图 ２ 淋球菌 RPA‐LFA 检出限样本检测结果图（１ ～ ４ ：１０ ５ cell／mL ；５ ～ １４ ：１０ ４ cell／mL）２ ． ３ RPA‐LFA 法与荧光定量 PCR 法检测结果一致性 如表 ３ ，荧光定量 PCR 法检测 ６１ 份样本 ，阳性占 ５４ ． １％ （３３／６１）
，RPA‐LFA 法检测 ６１ 份样本 ，阳性占 ５２ ． ５％ （３２／６１）
，两种方法的阳性率比较差异无显著性（ P ＞ ０.０５）
；两种方法检测结果一致性高（ Kappa ＝ ０ ．９７）
；以荧光定量 PCR 法为参照 ，RPA‐LFA 法的检测灵敏度为 ９６ ． ９７％ ，特异性为１００.００％ ，总体符合率为 ９８ ． ３６％ ，见表 ３ 。表 ３ RPA‐LFA 与荧光定量 PCR 检验结果对比淋球菌核酸检测荧光定量 PCR阳性 阴性 合计RPA‐LFA 阳性 ３２
０ 珑 ３２ 耨阴性 １ 镲 ２８ � ２９ 耨合计 ３３
２８ � ６１ 耨２ ． ４ 检测时间 荧光定量 PCR 方法流程时间为（１２０ ± ２０）min ，明显长于 RPA‐LFA 的（３５ ± ５）min分钟 ，且两者比较差异有显著性（ P ＜ ０.０５）。３ 讨论淋球菌的分离培养 ，敏感性与特异性高 ，适合各种标本 ，被认为是诊断淋球菌的“金标准” 。
而分离的菌株还可以用于药敏试验 。
但是由于淋球菌培养时间较长 ，而且万古霉素敏感株普遍存在 ，培养法有可能会造成漏检［３］。
分子生物学检查法是使用核酸扩增或非扩增技术 ，检测淋球菌的核酸 。
荧光定量PCR 是临床常使用的淋球菌核酸扩增检测技术 ，其检测淋球菌的阳性率要显著高于培养法［４］，而且用时更短 。
但是其检测需要昂贵的荧光定量 PCR 仪 ，并且需要专门的临床基因检测实验室和接受相关培训的专业人员 ，这些导致了检测和维护成本很高 ，难以在基层医院以及欠发达地区推广应用 。RPA 技术是一种新型等温扩增技术 ，自 ２００６年首次报道以来 ，已经在医疗诊断 、食品致病菌等检测分析方面崭露头角［５］。
RPA 使用两种主要的蛋白来代替 PCR 中通常的变性步骤 ：重组酶和单链结合蛋白［６］。
DNA 的复制则使用具有链置换活性的DNA 聚合酶以延伸引物 。
辅助蛋白和辅酶因子帮助重组酶与 DNA 形成核蛋白复合体 ，高分子物质充当拥挤剂 ，促使 RPA 的核心蛋白与 DNA 发生作用 ；肌酸激酶使用磷酸肌酸产生 ATP ，为系统中的酶提供能量［７］。
RPA 反应中 ，重组酶在装载因子的帮助下 ，和单链寡核苷酸引物与探针形成核蛋白复合体 。
核蛋白复合体扫描双链 DNA 目标 ，寻找同源序列 。
一旦同源序列被找到 ，核蛋白复合体插入双链 DNA ，使 DNA 链局部分离 ，形成 D 环结构 。目标链与引物杂交而互补链则被单链结合蛋白稳定 ；随着重组酶水解 ATP ，重组酶变从核蛋白复合体上脱离 。
引物则由链置换 DNA 聚合酶延伸 。
新形成的 DNA 链被用于另一轮的 RPA 。
最终 ，RPA完成指数级的扩增 ，直到磷酸肌酸耗尽［８］。RPA 的扩增产物的终点检测中使用较多的是侧向流层析分析 ，通常使用基于抗体的三明治法检测 ，这种方法需要形成带双标记的扩增产物［９］。RPA‐LFA 在通常的 RPA 体系中加入 nfo 探针和大肠杆菌核酸内切酶 Ⅳ （nfo）。
同时下游引物的 ５＇端标记生物素 。
nfo 探针‐５＇端含有荧光素标记 （６‐FAM）
，内部含有 THF 残基 ， ‐３＇端有阻止延伸的block 。
该 THF 残基能够被 nfo 酶识别和清除 ，这样暴露出‐３＇端的羟基 ，可以成为延伸的起点［１０］。RPA‐LFA 反应时 ，nfo 探针插入到目标链上 ，nfo 特· ４ ８ ９ · 医学临床研究 ２０２０ 年 ７ 月 第 ３７ 卷 第 ７ 期 J Clin Res ，Jul ．２０２０ ，Vol ３７ ， № ７
异性的识别探针中的 THF 残基 ，将其清除 ，暴露出可以延伸的‐３＇端羟基 。
而探针‐５＇端的 FAM 与下游引物‐５＇端的 Biotin 就形成了双标记的产物 。
RPA‐LFA 检测时 ，双标记产物与标记有 FAM 抗体的胶体金 ，形成金‐核酸复合物 。
当金‐核酸复合物经过 T线时 ，核酸另一端的 Biotin 被 T 线上的链霉亲和素捕获 ，形成 T 线显色 。
未被捕获的胶体金颗粒 ，继续行进至 C 线时 ，胶体金上的 FAM 抗体被二抗捕获 ，形成 C 线显色［１１］。RPA‐LFA 不需要反复升降温 ，反应温度范围较大 ，１５ ～ ５０ ℃ 条件下均可进行反应 ，反应时间通常为 ５ ～ ４５ min［１２］。
与荧光定量 PCR 方法相比 ，RPA‐LFA 流程时间更短 ，操作更简便 ，而且只需要水浴锅或金属浴就能进行反应 ，设备成本低 。本研究基于 RPA‐LFA 技术建立了淋球菌核酸快速检测方法 ，结果表明 ，该方法分析灵敏度与荧光定量 PCR 方法相当 ，分析特异性良好 ，与荧光定量PCR 方法检测结果一致性高 ，且单样本检测比荧光定量 PCR 方法更短 ，可适用于样本量少而分散的基层医院 ，具有一定的临床应用价值 。但是值得注意的是 ，对于...
篇四：上海核酸快速检测
交通大学硕士学位论文核酸探针应用于重金属的快速检测方法研究
硕 士 研 究 生 ：
王法泽 学号 ：
1101509050 导
师 ：
周 培 教授 申请 学 位 ：
农学硕士 学科 ：
植物保护 所
在
单
位 ：
农业与生物学院 答
辩
日
期 ：
2013 年 1 月 授予学位单位 ：
上海交通大学
Dissertation Submitted to Shanghai Jiao Tong University for the Degree of Master
STUDY ON RAPID DETERMINATION OF HEAVY METAL IONS BASED ON APTAMER TECHNOLOGY
Candidate：
Wang Faze Student ID: 1101509050 Supervisor：
Prof. Zhou Pei Academic Degree Applied for：
Master of Agriculture Speciality：
Plant Protection Affiliation：
School of Agriculture and Biology Date of Defence：
Jan. 2013 Degree-Conferring-Institution：
Shanghai Jiao Tong University
上海交通大学硕士学位论文 I
核酸探针应用于重金属的快速检测方法研究
摘 要
目前， 重金属污染已对人类生存环境造成了极大的威胁， 随着工业化的不断发展， 大量生活污水和工业废水排入水体， 进入水体的重金属离子可以通过生物链的蓄积进入人体， 严重威胁着人类的健康和安全。
因此， 为应对全球污染， 发展简单、 快速、 高效的重金属离子检测方法显得愈发重要。
核酸探针具有实时、 稳定、 灵敏等分析检测优点， 其在生化分析、 环境监测、 基础医学、 新药的合成及筛选等方面展现出广阔的应用前景。
因此， 在本文将以核酸适配子技术为基础，利用比色法对环境中银离子和砷离子进行痕量检测， 主要研究内容如下：
(1) 基于阳离子聚合物高效聚集纳米金比色法检测银离子。
阳离子聚合物聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)一方面可以与单链核酸(ssDNA)通过静电相互作用形成复合结构， 另一方面可以高效聚集纳米金。
当不加入银离子时， ssDNA 会与 PDDA 形成杂交结构， 由于 PDDA的消耗， 纳米金处于分散状态， 溶液成红色。
当加入银离子时， ssDNA中胞嘧啶(C)与 Ag+形成 C-Ag+-C 错配， 特异性结合形成发卡结构， 因此释放的 PDDA 会引起纳米金的聚集， 形成蓝色溶液。
随着 Ag+加入量的增加， 溶液由红色逐渐变为蓝色。
溶液在 650 nm 和 520 nm 处吸光度的比值与 Ag+的加入量成正向关系， 所以通过溶液颜色变化， 就可以实现水体中银离子检测， 并获得 48.6 nM 的检测限。
(2) 基于氯化血红素催化 TMB 显色比色法检测砷离子。
氯化血红素(Hemim)是金属卟啉化合物， 具有辣根过氧化物酶(HRP)活性， 在过氧化氢的存在下可以催化3,3"5,5"-四甲基联苯胺(TMB)形成蓝色阳离子根， 过量的 Hemin 可以继续催化阳离子根形成黄色的联苯醌。
当不加
上海交通大学硕士学位论文 II 入砷离子时， ssDNA 会抑制 Hemin 的催化活性。
当加入砷离子时，ssDNA 与 As(III)特异性结合形成复合结构， 这种复合结构会阻碍Hemin 与 ssDNA 的堆积作用， 恢复 Hemin 的催化能力， 加快黄色产物的生成。
随着砷加入量的增加， 溶液由蓝色逐渐变为黄色。
溶液在 442 nm 处吸光度与砷的加入量成正向关系， 所以通过溶液颜色变化， 可以实现水体中砷离子检测。
关键词：
核酸适配体、 比色法、 银离子、 砷离子
上海交通大学硕士学位论文 III STUDY ON RAPID DETERMINATION OF HEAVY METAL IONS BASED ON APTAMER TECHNOLOGY ABSTRACT Heavy metal ions are one kind of main pollutants in the environment, which have caused great threat to human living conditions. With the rapid development of urban industrialization, life sewage and industry waste water are drained into water environment. Heavy metal ions can be accumulated into the human body through the food chain, leading a serious threat to people"s health and life. Therefore, it is of great significance to establish a simple, fast, sensitive method to detect them.
Nucleic acids (ssDNA) with advantages of real-time, quick, stable, selective and visual inspection make its broad space to be used in bioanalytical assay, environment monitoring, basic medicine, new drug synthesis or selection. In this research paper, new assays to determine the silver and arsenic ions were established based on colorimetric methods. The major contents of this thesis are given in the following．
(1) Poly-(diallyldimethylammonium chloride) (PDDA), a cationic conjugated polymer, was used and displays two useful features in the present biosensor. One of useful property of PDDA is that it can electrostatically interact with negatively charged ssDNA strands to form a ‗‗duplex‘‘ structure. Another useful property of PDDA lies in its positive charge, which can be employed to aggregate citrate-stabilized AuNPs into stable nanochains. First, in the presence of Ag+, the Ag+ aptamer form stable hair-pin structure through the specific C-Ag+-C interactions. As a result, the duplex DNA formed in this way cannot interact with PDDA effectively. The subsequent PDDA can aggregate AuNPs, which leads to the remarkable change in color from wine red to blue. However, in the absence of Ag+, the aptamers are free and can hybridize with PDDA to form a ‗‗duplex‘‘
上海交通大学硕士学位论文 IV structure through electrostatic interaction, thus the subsequent AuNPs cannot aggregate owing to the lack of PDDA. Therefore, this strategy makes it possible to detect Ag+ by colorimetric assay, with a limit of detection of 48.6 nM. (2) Hemin (iron protoporphyrin) is the active center of heme- proteins, which has the peroxidase-like activity similar to the peroxidase enzyme. In the presence of hydrogen peroxide, hemin can catalyze 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) to form a blue charge-transfer intermediate and the excess hemin can continue catalytic to form a yellow final product. In the absence of As(III) ions, the As aptamer will affect the catalytic activity through π-π interaction. But, in the of presence As(III) ions, the ssDNA can form stable duplex structure through the specific interactions. This duplex structure can‘t absorb hemin and accelerate the formation of the yellow product. With the increase of the added amount of arsenic, the solution gradually changed from blue to yellow. Therefore, by the color change of the solution, the arsenic ions in water can be detected.
KEY WORDS: aptamer, colorimetric, silver, arsenic
上海交通大学硕士学位论文 V 目 录
摘 要 ································································································· I 第一章 绪论 ······················································································· 1 1.1 重金属离子污染 .................................................................................................. 1 1.1.1 重金属离子污染的现状及危害 ··················································· 1 1.1.2 重金属污染的分类 ·································································· 2 1.1.3 重金属离子检测的方法及意义 ··················································· 3 1.2 核酸适配子技术 .................................................................................................. 5 1.2.1 核酸适配子技术的特点 ···························································· 6 1.2.2 核酸适配子在检测金属离子中的应用 ·········································· 6 1.3 本课题的研究意义及内容 ................................................................................ 15 第二章 基于阳离子聚合物高效聚集纳米金比色法检测银离子 ······················· 16 2.1 引言 .................................................................................................................... 16 2.2 仪器与试剂 ........................................................................................................ 17 2.2.1 实验仪器 ············································································· 17 2.2.2 实验试剂及配制 ···································································· 17 2.3 实验设计原理与方法 ........................................................................................ 18 2.3.1 实验原理 ············································································· 18 2.3.2 实验方法 ············································································· 19 2.4 实验结果与讨论 ................................................................................................ 20 2.4.1 不同粒径纳米金的制备 ··························································· 20 2.4.2 圆二色谱光谱特征 ································································· 22 2.4.3 电子透射电镜及吸收光谱特征 ·················································· 23 2.4.4 条件优化 ············································································· 25 2.4.5 盐浓度影响 ·········································································· 28 2.4.6 工作曲线和选择性 ································································· 29 2.4.7 分析应用 ············································································· 31 2.5 小结 .................................................................................................................... 32 第三章 基于氯化血红素催化 TMB 显色比色法检测砷离子 ··························· 33
上海交通大学硕士学位论文 VI 3.1 引言 .................................................................................................................... 33 3.2 仪器与试剂 ........................................................................................................ 34 3.2.1 实验仪器 ············································································· 34 3.2.2 实验试剂及配制 ···················...
篇五：上海核酸快速检测
20/3/30 国家药监局应急批准新冠病毒核酸快速检测试剂https://www.cmde.org.cn/CL0004/20689.html 1/2首页 中心建设 最新要闻 工作动态 公告通知 法规文件 中心规章 指导原则 审评论坛 办事大厅 数据库查询 网站地图国家药监局应急批准新冠病毒核酸快速检测试剂2020-03-27 20:00 近日，国家药监局再次应急批准1个新冠病毒核酸快速检测产品，进一步服务于疫情防控需要。 上海仁度生物科技有限公司开发的新冠病毒2019-nCoV核酸检测试剂, 采用RNA特异靶标捕获和转录介导的恒温扩增实时检测技术，在一个反应管中自动化完成核酸提取、扩增步骤，90分钟可出结果，并可实现连续并行检测，提升检测效率。相关数据显示，检测结果灵敏度、特异性能够达到传统PCR方法的水平。 此前，国家药监局已应急批准杭州优思达生物技术有限公司新冠病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（恒温扩增-实时荧光法）、安邦（厦门）生物科技有限公司新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（杂交捕获免疫荧光法）2个核酸快速检测试剂产品。 上述3个核酸快速检测试剂，缩短了核酸检测试剂的检测时间，提高了检测效率，全力服务疫情防控需要。 国家药监局还应急批准了上海复星长征医学科学有限公司新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）产品，进一步扩大了疫情防控用检测试剂的供应。 截至目前，国家药监局已经应急批准23个新型冠状病毒检测产品，其中新冠病毒核酸检测试剂15个，抗体检测试剂8个。 已批准新型冠状病毒检测试剂序号 产品名称 注册人 注册证号1新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）上海之江生物科技股份有限公司国械注准202034000572新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）上海捷诺生物科技有限公司国械注准202034000583新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）华大生物科技（武汉）有限公司国械注准202034000594新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）华大生物科技（武汉）有限公司国械注准202034000605新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）中山大学达安基因股份有限公司国械注准202034000636新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）圣湘生物科技股份有限公司国械注准202034000647新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）上海伯杰医疗科技有限公司国械注准202034000658新型冠状病毒（2019-nCoV）抗体检测试剂盒（胶体金法）广州万孚生物技术股份有限公司国械注准202034001769新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗体检测试剂盒（胶体金法）英诺特（唐山）生物技术有限公司国械注准202034001772020/3/30 国家药监局应急批准新冠病毒核酸快速检测试剂https://www.cmde.org.cn/CL0004/20689.html 2/210 六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒（恒温扩增芯片法）成都博奥晶芯生物科技有限公司国械注准2020340017811新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）北京卓诚惠生生物科技股份有限公司国械注准2020340017912新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）博奥赛斯（重庆）生物科技有限公司国械注准2020340018213新型冠状病毒（2019-nCoV）IgG抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）博奥赛斯（重庆）生物科技有限公司国械注准2020340018314新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）迈克生物科技股份有限公司 国械注准2020340018415新型冠状病毒（2019-nCoV）抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）厦门万泰凯瑞生物技术有限公司国械注准2020340019816新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM抗体检测试剂盒（胶体金法）广东和信健康科技有限公司 国械注准2020340019917新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）武汉明德生物科技股份有限公司国械注准2020340021218新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗体检测试剂盒（胶体金法）南京诺唯赞医疗科技有限公司国械注准2020340023919新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗体检测试剂盒（胶体金法）珠海丽珠试剂股份有限公司 国械注准2020340024020新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（恒温扩增-实时荧光法）杭州优思达生物技术有限公司国械注准2020340024021新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（杂交捕获免疫荧光法）安邦（厦门）生物科技有限公司国械注准2020340029822新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）上海复星长征医学科学有限公司国械注准2020340029923新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（RNA捕获探针法）上海仁度生物科技有限公司 国械注准20203400300使用指南 | 网站地图地址：北京市海淀区气象路50号院1号楼 邮编：100081 电话：010-86452722本站由国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心主办 版权所有 未经许可禁止转载或建立镜像Copyright 2007-2019 CMDE All Rights Reserved备案序号：京ICP备08100530号